Untersuchungen zur Vorhersage des karzinogenen Potenzials verschiedener Nitrosamine

© Fraunhofer ITEM, Christina Ziemann
Der Comet-Assay, auch Einzelzellgelelektrophorese genannt, ist ein Gentoxizitätstest, der DNA-Schäden auf dem Niveau der Einzelzelle anzeigt. Hier wurden Zellen mit Ethylmethansulfonat behandelt, das DNA-Strangbrüche auslöst, und anschließend einer Gelelektrophorese unterzogen. Nach Färbung erscheinen kometenähnliche Gebilde, wobei die helleren »Köpfe« des Kometen ungeschädigte DNA darstellen und der »Schweif« DNA-Fragmente, die im elektrischen Feld entsprechend ihrer Größe gewandert sind.

In den letzten Jahren kam es zu Arzneimittelrückrufen, weil geringe Mengen von Verunreinigungen in Form von N-Nitrosaminen (NA) festgestellt wurden. NA gelten als potente Kanzerogene, die einen gentoxischen Wirkmechanismus aufweisen. Daher haben die Regulierungsbehörden unlängst einen sehr niedrigen Schwellenwert von 18 ng/d für all jene NA festgelegt, für die keine spezifischen Kanzerogenitätsstudien vorliegen. Ist dieser Schwellenwert tatsächlich für alle Arten von NA gerechtfertigt? Dieser Frage wird im Projekt MutaMind nachgegangen. In diesem von der Europäische Arzneimittelagentur EMA geförderten und vom Fraunhofer ITEM geleiteten Projekt arbeiten acht Partner – aus dem akademischen Bereich, einer Regulierungsbehörde und einem Auftragsforschungsinstitut – daran, die Prozesse, die zur Mutagenität von NA beitragen, besser zu verstehen und passgenaue In-vitro-Nachweismethoden für ein sensitives Gentoxizität-Screening zu entwickeln. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf NA, die von Arzneimitteln abgeleitet sind.

Zu diesem Zweck prüft das Konsortium rund 40 NA und deren Fähigkeit, nach metabolischer Aktivierung verschiedene DNA-Addukte, also chemische Veränderungen an den Basen der DNA, auszulösen. Unterschiede in den entsprechenden Reparaturmechanismen werden mithilfe von Zellmodellen (Mensch und Maus) untersucht, die entweder fähig oder unfähig sind, DNA-Addukte zu reparieren.

Um an NA angepasste, sensitive und prädiktive Verfahren für das Gentoxizitäts-Screening zu definieren, werden sowohl Basenmutationen als auch DNA-reparaturabhängige DNA-Strangbrüche als Endpunkte verwendet. Beim Standard-Ames-Test untersuchen die Forschenden, wie sich Art und Menge der Lösungsmittel und das metabolische Aktivierungssystem (Ratte versus Hamster) auf den Nachweis mutagener NA auswirken. Außerdem werden Nutzen und Praktikabilität des Ames-Fluktuationstests für die NA-Testung untersucht. Als alternative Möglichkeit werden Sensitivität und Vorhersagekraft des alkalischen In-vitro-Comet-Assays in verschiedenen Leberzellmodellen (HepG2-Zellen, primäre Leberzellen von Mensch und Ratte) untersucht. Erste vielversprechende Ergebnisse mit primären Leberzellen wurden bereits erzielt.

Zur Vervollständigung des Bildes wird die endogene Bildung von NA durch Bakterien aus dem menschlichen Magen- und Darmmikrobiom erforscht. Dafür werden Bakterien unter anaeroben Bedingungen kultiviert und entweder einzeln oder in Kombination unter physiologischen Bedingungen gegenüber verschiedenen Medikamenten exponiert. Erste Ergebnisse zeigen bereits Unterschiede in der Kinetik der NA-Bildung.

Die gewonnenen Daten sollen schließlich dazu dienen, auf der Grundlage struktureller Eigenschaften und biologischer Wirkungen Gruppen potenter mutagener NA besser von weniger potenten NA zu unterscheiden.

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Sylvia Escher

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Dr. Sylvia Escher

Bereichsleiterin Sicherheitsbewertung und Toxikologie & Abteilungsleiterin In-silico-Toxikologie

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Christina Ziemann

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Dr. Christina Ziemann

Arbeitsgruppenleiterin Genetische Toxikologie

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