RNA-Technologien

RNA-basierte Wirkstoffe bis zum klinischen Einsatz entwickeln

Mit RNA zielgerichtet therapieren

Um die molekularen Signalwege in gesunden und kranken Herzen besser zu verstehen, analysieren Forschende nicht-codierende Mikro-RNAs mithilfe der Real-time-PCR. Mikro-RNAs, die im Zusammenhang mit der Krankheit stehen, wie  etwa die Mikro-RNA-132, können somit identifiziert werden.
© Fraunhofer ITEM, Ralf Mohr
Um die molekularen Signalwege in gesunden und kranken Herzen besser zu verstehen, analysieren Forschende nichtcodierende Mikro-RNA-Moleküle mithilfe der Real-time-PCR.
© Fraunhofer ITEM, Ralf Mohr
Die Prozessentwicklung und GMP-Produktion von mRNA-Therapeutika für frühe klinische Studien kann direkt im Fraunhofer ITEM erfolgen.

RNA-basierte Medikamente bieten als Wirkstoffklasse ein enormes Potenzial für die Medizin und deren Möglichkeiten sind bei weitem noch nicht ausgeschöpft. Am Fraunhofer ITEM entwickeln Forschende neue Medikamente und Verfahren für RNA-basierte Therapiekonzepte.

Der gezielte Einsatz von RNA-Wirkstoffen aus codierenden oder nichtcodierenden RNA-Sequenzen ermöglicht eine maßgeschneiderte Reaktion der jeweiligen Zielzellen bei bestimmten Krankheitsbildern. Fraunhofer-Forschende nutzen verschiedenste RNA-basierte Wirkstoffe, wie small interfering-RNAs (siRNA), Nukleosid-modifizierte Messenger-RNAs (modRNA) oder RNA-Blocker – von der Target-Findung bis hin zum klinischen Einsatz. Dabei spielen bioinformatische Modelle eine wichtige Rolle, um krankheitsassoziierte RNAs auszuwählen, deren Interaktion mit anderen Genen zu studieren und das optimale Design von Wirkstoffen zu entwickeln.

Für den zielgerichteten Einsatz der RNA-Wirkstoffe werden spezielle virale und nichtvirale Applikationstechnologien auf molekularer und apparativer Ebene entwickelt. Insbesondere für RNA-Therapeutika gegen Lungenerkrankungen ist die lokale Verabreichung über die Atemwege durch Inhalation vielversprechend. Denn sie gelangen dadurch direkt an den Wirkort, wobei die systemische Medikamentenexposition minimiert wird.

Sicherheit und Wirksamkeit von RNA-Wirkstoffen prüfen

Zur Bewertung der Sicherheit und Prüfung der therapeutischen Wirksamkeit nutzen die ITEM-Forschenden vorhandene und entwickeln neue Modellsysteme, die auf menschlichen Zellen und Geweben basieren. Außerdem können sie RNA-Therapeutika in frühen klinischen Studien prüfen.

Prozessentwicklung und GMP-Produktion von RNA-basierten Arzneimitteln

Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler am Fraunhofer ITEM entwickeln Bioprozessverfahren und Produktionstechnologien für die modulare, automatisierte und bis zum Industriemaßstab skalierbare Herstellung von RNA-Molekülen und RNA-Nanotransportern.

Schnelle, sichere und zuverlässige Produktionstechnologien zur Herstellung RNA-basierter Impfstoffe und Arzneimittel sind eine wesentliche Voraussetzung für eine erfolgreiche Translation in den Markt.

Um dies zu unterstützen, erfolgt die Prozessentwicklung und GMP-Produktion von mRNA-Therapeutika für frühe klinische Studien direkt im Fraunhofer ITEM. Hier können auch die frühen klinischen Studien durchgeführt werden.

RNA-Moleküle als Biomarker

Auch für die Diagnostik werden verschiedene RNA-Moleküle zunehmend interessant. Bei vielen Erkrankungen, u. a. Herz-Lungenerkrankungen und Krebs, sind die Expressionsprofile der RNA-Moleküle verändert. RNA kann aus verschiedenen Flüssigbiopsien gewonnen werden, beispielsweise aus Blut, Urin oder Nervenwasser. Für die Patienten ist die Entnahme einer Flüssigbiopsie deutlich weniger invasiv als eine Gewebebiopsie. Mittels Technologien des sogenannten Next Generation Sequencing kann die RNA-Zusammensetzung einer Probe bestimmt werden.

RNA-Expressionsprofile können somit als Biomarker genutzt werden, um eine Erkrankung zu charakterisieren, das Ansprechen auf eine bestimmte Therapie vorherzusagen und den Therapieerfolg zu überwachen. Forschende am Fraunhofer ITEM haben Technologien entwickelt, um kleinste RNA-Mengen untersuchen zu können, wodurch auch die Bestimmung der Expressionsprofile von einzelnen Zellen oder zellfreier, zirkulierender RNA (cfRNA) möglich wird.

mRNA- und miRNA-Expressionsprofile als Biomarker
© Fraunhofer ITEM, Ralf Mohr
Bisher werden hauptsächlich mRNA- und miRNA-Expressionsprofile als Biomarker genutzt, wobei sich auch zirkuläre RNA (circRNA) mehr und mehr zu einem Biomarker mit großem Potenzial entwickeln.

Unsere Technologien und Methoden

Identifizierung von Zielstrukturen

© Fraunhofer ITEM, Ralf Mohr

Über computerbasierte Modelle können Hinweise für molekulare RNA-Zielstrukturen in verschiedenen humanen Organpathologien erfasst werden.

Auf Basis dieser Strukturen können RNA-Wirkstoffkandidaten synthetisiert und nachfolgend in translationalen Modellsystemen validiert werden. 

Lead-Optimierung

© Fraunhofer ITEM, Ralf Mohr

Analytische Verfahren sind für die Optimierung RNA-modulierender Wirkstoffe unerlässlich. Mittels Oligonukleotid-basierter Bindungsanalytik wird die Wirkstoffstruktur vorab validiert und entsprechend angepasst.

Die darauf aufbauende Effizienztestung und Pharmakokinetik erfolgen ebenfalls mithilfe bioanalytischer Methoden. Außerdem stehen Plattformen für Mikroskalige-Thermophorese (MST) und HPLC zur Verfügung.

 

Effizienz-Testung in humanen Modellsystemen und RNA-Analytik (PK/PD-Studien)

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Humane und tierische Zell- und Gewebekulturmodelle

Herz

  • Zellkulturen
  • Herzgewebeschnitte
  • 3D-Organoidmodelle

Lunge

  • Zellkulturen
  • Isoliert Perfundierte Lunge
  • Präzisionslungenschnitte(PCLS)
  • 3D-Organoidmodelle

Leber

  • Zellkulturen
  • Präzisionsleberschnitte (PCLiS)

 

Toxikologie (in vitro/in vivo)

  • Präklinische Prüfungen in vivo
  • Präklinische Prüfungen anhand verschiedener In-vitro- und Ex-vivo-Modelle von Lunge und Herz
  • Sicherheitspharmakologie
  • Toxikologische Risikobewertung
    • Identifizierung und Nutzung prädiktiver Biomarker für toxikologische Endpunkte
    • Generierung mechanistischer Daten zur Unterstützung des sogenannten »Next-Generation Risk Assessment«
    • Bewertung von gentoxischen Verunreinigungen gemäß ICH M7 einschließlich Literaturrecherche, QSAR-Analyse und PDE-Ableitung

 

© Fraunhofer ITEM, Ralf Mohr

Herstellung von mRNA

© Fraunhofer ITEM, Ralf Mohr
  • Plasmidproduktion und -reinigung bis zu 400 L Fermentationsmaßstab, EU-GMP-Herstellungserlaubnis vorhanden.
  • Enzymatische In-vitro-Transkription, Funktionalisierung und Reinigung von mRNA als Wirkstoff (bis zum Gramm-Maßstab)
  • Mikrofluidische Formulierung von mRNA-LNPs als formulierte Bulkware
  • Automatisierte oder manuelle aseptische Abfüllung von mRNA-LNPs als Arzneimittel bis zu 7.000 10R-Vials (Klasse A in B-Reinraumumgebung, Media-Fill validiert). Andere Abfüllformate sind auf Anfrage möglich.
  • QC-Analytik für IPC und Freigabeanalytik von Arzneimitteln inhouse, ggf. bei qualifizierten Analytik-Dienstleistern
  • Inhouse QP verfügbar, mRNA-Therapeutika können freigegeben und als IMP für die klinische Anwendung geliefert werden

RNA Targeted Delivery

Für die Entwicklung einer zielgerichteten, organspezifischen Verabreichung von RNA-Therapeutika werden verschiedene Technologien und kardiopulmonale 2D- und 3D-Modellsysteme genutzt.

  • Bioanalytik für therapeutische RNA-Interaktion mit Zielsequenz
  • Herstellung und Validierung von Nanopartikeln als Träger für RNA-Therapeutika
  • Biologische Validierung von RNA-Nanopartikelkomplexen
  • Entwicklung zelltypspezifischer Nanopartikel 
  • Vernebelung von RNA-Nanopartikelkomplexen 
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Klinische Phase-I/II-Testung

Proband wird von Studienarzt untersucht und informiert
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  • Phase-I-Einheit und Infrastruktur für klinische Forschung
  • Breites Diagnostikspektrum für die Sicherheits- und Wirksamkeitsbewertung
    • MRT-Darstellung Belüftung und Durchblutung der Lunge
    • EKG, Echokardiografie und Telemetrie
  • Kontrollierte Aerosolinhalation
  • Vielfältige Provokationsmodelle für frühen Proof-of-Concept 

RNA-Technologien: Aktuelle Projekte und Highlights

 

RNA-Therapie gegen Herzinsuffizienz und Organfibrosen

Prof. Dr. Dr. Thomas Thum, Institutsleiter des Fraunhofer ITEM, hat eine RNA-Therapie gegen Herzinsuffizienz entwickelt und in einer klinischen Phase-1b-Studie bereits erfolgreich an Patienten getestet.

 

Projekt RNAuto

Fraunhofer entwickelt automatisierte Produktionstechnologien für mRNA-basierte Arzneimittel.

RNA-Medikament gegen Herzfibrose

EU fördert Forschungsprojekt mit rund 2,5 Millionen Euro.

Entwicklungspipeline für RNA-Medikamente

Schnelle Therapieansätze gegen Viruserkrankungen: Forschungsteam von Fraunhofer ITEM und Medizinischer Hochschule Hannover bei europaweiter SPRIND-Challenge erfolgreich.

 

Projekt Cell Painting

Fraunhofer-Forschende etablieren ein vielversprechendes Werkzeug zur Risikobewertung der nächsten Generation. 

 

Projekt ZET-O-MAP

Forschenden des Fraunhofer ITEM gelingt die Entwicklung einer Analyse-Pipeline zum Biomarkernachweis für Entwicklungstoxizität.

RNA-Typen

RNA kann in vielen Varianten vorkommen. Am bekanntesten ist die Messenger-RNA (mRNA). Sie codiert Baupläne für Proteine wie für das SARS-CoV-2-Spikeprotein in den Corona-Impfstoffen. Neben der mRNA gibt es im Organismus aber eine Vielzahl weiterer RNA-Moleküle. Diese sogenannten nichtcodierenden RNAs, zu denen z. B. auch Mikro-RNAs (miRNA), lange nichtcodierende RNAs (lncRNAs) und zirkuläre RNAs (circRNA) gehören, übernehmen wichtige Steuerungsaufgaben in der Zelle. Werden sie fehlreguliert, kann dies zur Entstehung verschiedenster Krankheiten führen, weshalb sie entscheidende therapeutische Zielstrukturen darstellen.

Messenger-RNA

 

Die Messenger-RNA (mRNA), auch Boten-RNA genannt, ist eine einzelsträngige Ribonukleinsäure, die genetische Information für den Aufbau eines bestimmten Proteins in einer Zelle überträgt.

Bei Medikamenten, die auf mRNA basieren, gelangt die Information zur Herstellung eines spezifischen Proteins in die Zellen, die dann dieses Protein produzieren.

Bei mRNA-Impfstoffen wirkt das produzierte Protein als Antigen, das eine Immunantwort zum Schutz aufbaut.

Mikro-RNA

 

Mikro-RNA (miRNA), sind kurze, hoch konservierte, nichtcodierende Ribonukleinsäuren, die eine wichtige Rolle in dem komplexen Netzwerk der Genregulation.

Die verschiedenen miRNA-Moleküle regulieren die Genexpression hochspezifisch auf der post-transkriptionalen Ebene und eignen sich daher als therapeutische Zielstrukturen.

Small interfering RNA

 

Als small interfering RNA (siRNA) werden synthetisch hergestellte RNA-Moleküle bezeichnet, die in der Forschung oder auch als therapeutische Wirkstoffe eingesetzt werden. Durch chemische Synthese lassen sich siRNA-Moleküle mit jeder gewünschten Sequenz herstellen.

Um siRNA in Zellen hineinzubringen, wird überwiegend die sogenannte Liposomale Transfektion genutzt. Dazu wird die RNA mit Liposomen gekoppelt, die mit der Zellmembran der Zielzellen verschmelzen und die siRNA so in die Zelle einschleusen.

Zirkuläre RNA

 

Zirkuläre RNA (circRNA) ist eine Art von einzelsträngiger Ribonukleinsäure, die im Gegensatz zu linearer RNA eine kovalent geschlossene Endlosschleife bildet.

Da zirkuläre RNA keine 5'- oder 3'-Enden hat, ist sie resistent gegen den Exonuklease-vermittelten Abbau und vermutlich stabiler als die meisten linearen RNAs in den Zellen. circRNA hat u. a. genregulatorische Funktionen und wurde mit einigen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht. Die biologische Funktion der meisten circRNA-Moleküle ist unklar.

Inc-RNA

 

Lange nichtcodierende RNAs (lncRNA) sind allgemein definiert als Transkripte mit mehr als 200 Nukleotiden, die nicht in Protein übersetzt werden.

Sie sind beteiligt an der Genregulation auf transkriptioneller, posttranskriptioneller sowie auf epigenetischer Ebene und haben Einfluss auf den DNA-Replikationszeitpunkt und die Chromosomenstabilität.

modRNA

 

Nukleosid-modifizierte Messenger-RNA (modRNA) ist eine synthetische, chemisch modifizierte mRNA, in der einzelne Nukleoside durch modifizierte Nukleoside oder durch synthetische Nukleosid-Analoga ersetzt sind.

Diese RNA-Moleküle werden experimentell oder therapeutisch eingesetzt, um in bestimmten Zellen die Produktion eines gewünschten Proteins zu induzieren.

Publikationen

  • Foinquinos A, Batkai S, Genschel C, Viereck J, Rump S, Gyöngyösi M, Traxler D, Riesenhuber M, Spannbauer A, Lukovic D, Weber N, Zlabinger K, Hašimbegović E, Winkler J, Fiedler J, Dangwal S, Fischer M, de la Roche J, Wojciechowski D, Kraft T, Garamvölgyi R, Neitzel S, Chatterjee S, Yin X, Bär C, Mayr M, Xiao K, Thum T. Preclinical development of a miR-132 inhibitor for heart failure treatment. Nature Commun. 2020;11:633. https://www.nature.com/articles/s41467-020-14349-2
  • Gupta SK, Garg A, Bar C, Chatterjee S, Foinquinos A, Milting H, Streckfuss-Bomeke K, Fiedler J, Thum T. Quaking Inhibits Doxorubicin-Mediated Cardiotoxicity Through Regulation of Cardiac Circular RNA Expression. Circ Res. 2018;122:246-254. https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCRESAHA.117.311335
  • Hedayatollah Hosseini, Milan M.S. Obradović, Martin Hoffmann, Kathryn Harper, Maria Soledad Sosa, Melanie Werner-Klein, Lahiri Kanth Nanduri, Christian Werno, Carolin Ehrl, Matthias Maneck, Nina Patwary, Gundula Haunschild, Miodrag Gužvić, Christian Reimelt, Michael Grauvogl, Norbert Eichner, Florian Weber, Andreas Hartkopf, Florin-Andrei Taran, Sara Y. Brucker, Tanja Fehm, Brigitte Rack, Stefan Buchholz, Rainer Spang, Gunter Meister, Julio A. Aguirre-Ghiso, Christoph A. Klein. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. Author manuscript; available in PMC 2017 Jun 15. Published in final edited form as: Nature. 2016 Dec 22; 540(7634): 552–558. Published online 2016 Dec 14. doi: 10.1038/nature20785 https://www.nature.com/articles/nature20785
  • Sarah M. Hücker, Tobias Fehlmann, Christian Werno, Kathrin Weidele, Florian Lüke, Anke Schlenska-Lange, Christoph A. Klein, Andreas Keller and Stefan Kirsch. Single-cell microRNA sequencing method comparison and application to cell lines and circulating lung tumor cells. Nat Commun. 2021; 12: 4316., Published online 2021 Jul 14. doi: 10.1038/s41467-021-24611-w https://www.nature.com/articles/s41467-021-24611-w
  • Piccoli MT, Gupta SK, Viereck J, Foinquinos A, Samolovac S, Kramer FL, Garg A, Remke J, Zimmer K, Batkai S, Thum T. Inhibition of the Cardiac Fibroblast-Enriched lncRNA Meg3 Prevents Cardiac Fibrosis and Diastolic Dysfunction. Circ Res. 2017;121:575-583 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28630135/
  • Schimmel K, Jung M, Foinquinos A, José GS, Beaumont J, Bock K, Grote-Levi L, Xiao K, Bär C, Pfanne A, Just A, Zimmer K, Ngoy S, López B, Ravassa S, Samolovac S, Janssen-Peters H, Remke J, Scherf K, Dangwal S, Piccoli MT, Kleemiss F, Kreutzer FP, Kenneweg F, Leonardy J, Hobuß L, Santer L, Do QT, Geffers R, Braesen JH, Schmitz J, Brandenberger C, Müller DN, Wilck N, Kaever V, Bähre H, Batkai S, Fiedler J, Alexander KM, Wertheim BM, Fisch S, Liao R, Diez J, González A, Thum T. Natural Compound Library Screening Identifies New Molecules for the Treatment of Cardiac Fibrosis and Diastolic Dysfunction. Circulation. 2020;141:751-767 https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.119.042559
  • Täubel J, Hauke W, Rump S, Viereck J, Batkai S, Poetzsch J, Rode L, Weigt H, Genschel C, Lorch U, Theek C, Levin AA, Bauersachs J, Solomon SD, Thum T. Novel antisense therapy targeting microRNA-132 in patients with heart failure: results of a first-in-human phase 1b randomised, double-blind, placebo-controlled study. Eur Heart J. 2021;42:178-188 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7954267/
  • Thum T, Gross C, Fiedler J, Fischer T, Kissler S, Bussen M, Galuppo P, Just S, Rottbauer W, Frantz S, Castoldi M, Soutschek J, Koteliansky V, Rosenwald A, Basson MA, Licht JD, Pena JT, Rouhanifard SH, Muckenthaler MU, Tuschl T, Martin GR, Bauersachs J, Engelhardt S (2008) MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts. Nature. 2008;456:980-984 https://www.nature.com/articles/nature07511.
  • Ucar A, Gupta SK, Fiedler J, Erikci E, Kardasinski M, Batkai S, Dangwal S, Kumarswamy R, Bang C, Holzmann A, Remke J, Caprio M, Jentzsch C, Engelhardt S, Geisendorf S, Glas C, Hofmann TG, Nessling M, Richter K, Schiffer M, Carrier L, Napp LC, Bauersachs J, Chowdhury K, Thum T. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nat Commun. 2012;3:1078. https://www.nature.com/articles/ncomms2090
  • Ucar A, Vafaizadeh V, Jarry H, Fiedler J, Klemmt PA, Thum T, Groner B, Chowdhury K. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 2010;42:1101-1108. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21057503/
  • Viereck J, Bührke A, Foinquinos A, Chatterjee S, Kleeberger JA, Xiao K, Janssen-Peters H, Batkai S, Ramanujam D, Kraft T, Cebotari S, Gueler F, Beyer AM, Schmitz J, Bräsen JH, Schmitto JD, Gyöngyösi M, Löser A, Hirt MN, Eschenhagen T, Engelhardt S, Bär C, Thum T. Targeting muscle-enriched long non-coding RNA H19 reverses pathological cardiac hypertrophy. Eur Heart J. 2020;41:3462-3474 https://academic.oup.com/eurheartj/article/41/36/3462/5870446
  • Viereck J, Kumarswamy R, Foinquinos A, Xiao K, Avramopoulos P, Kunz M, Dittrich M, Maetzig T, Zimmer K, Remke J, Just A, Fendrich J, Scherf K, Bolesani E, Schambach A, Weidemann F, Zweigerdt R, de Windt LJ, Engelhardt S, Dandekar T, Batkai S, Thum T. Long noncoding RNA Chast promotes cardiac remodeling. Sci Transl Med. 2016;8:326ra322 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26888430/ 
  • Melanie Werner-Klein, Ana Grujovic, Christoph Irlbeck, Milan Obradović, Martin Hoffmann, Huiqin Koerkel-Qu, Xin Lu, Steffi Treitschke, Cäcilia Köstler, Catherine Botteron, Kathrin Weidele, Christian Werno, Bernhard Polzer, Stefan Kirsch, Miodrag Gužvić, Jens Warfsmann, Kamran Honarnejad, Zbigniew Czyz, Giancarlo Feliciello, Isabell Blochberger, Sandra Grunewald, Elisabeth Schneider, Gundula Haunschild, Nina Patwary, Severin Guetter, Sandra Huber, Brigitte Rack, Nadia Harbeck, Stefan Buchholz, Petra Rümmele, Norbert Heine, Stefan Rose-John, Christoph A. Klein. Interleukin-6 trans-signaling is a candidate mechanism to drive progression of human DCCs during clinical latency. Nat Commun. 2020; 11: 4977. Published online 2020 Oct 5. doi: 10.1038/s41467-020-18701-4 https://www.nature.com/articles/s41467-020-18701-4