Therapie- und Metastasierungsmodelle

Das Konzept der personalisierten Tumortherapie basiert auf dem maßgeschneiderten Einsatz spezifischer Wirkstoffe zur Behandlung einer individuellen Krebserkrankung. Große Vorteile für die Entwicklung solcher Strategien bietet – neben ausführlichem Wissen über die molekularen Eigenschaften der Tumorerkrankung – auch die Verwendung von Zellmodellen, welche die tatsächlichen Zielzellen individueller Therapien repräsentieren.

Solche Zellmodelle werden benötigt, um neue Medikamente zu testen und um die Biologie spezifischer Tumorzellpopulationen zu untersuchen. Bereits gestreute Tumorzellen, wie disseminierte Tumorzellen (DTC), die Vorläuferzellen von Metastasen, und im Blut zirkulierende Tumorzellen (CTC), stellen wichtige Zielzellen für spezifische Therapieansätze in metastasierten Patienten dar.

Aufgrund der sehr geringen Anzahl von DTC bzw. CTC und der damit verbundenen Problematik ihrer Detektion und Anreicherung ist es zurzeit beinahe unmöglich, diese Zellen zu expandieren und dadurch repräsentative Modelle für eine Medikamententestung zu etablieren. Die Verwendung von auf diesen seltenen Zellen basierenden Zellmodellen ermöglicht es, das Verständnis des Metastasierungsprozesses zu vertiefen sowie neue Medikamente besser testen zu können.

Präklinische In-vitro-/In-vivo-Modelle sind essenziell für die Entwicklung von Krebsmedikamenten. Allerdings zeigt sich mehr und mehr, dass Zellmodelle, welche auf Primärtumoren basieren, nur unzureichende Informationen zur Behandlung bereits gestreuter Tumorzellen liefern. DTC und CTC hingegen stellen die Zielzellen solcher Therapien dar. Das Fraunhofer ITEM in Regensburg entwickelt Verfahren zur Expansion seltener Zellen und hat bereits erste In-vitro-/In-vivo-Modelle basierend auf DTC bzw. CTC etabliert. Wir nutzen diese Modelle, um ein besseres funktionelles Verständnis der Biologie sowie des Therapieansprechens von DTC und CTC zu gewinnen.

DTC und CTC sind sehr seltene Tumorzellen, welche im Knochenmark und/oder Lymphknoten bzw. im Blut von Krebspatienten gefunden werden können. Um diese seltenen Zellen lebend zu isolieren und zu vervielfältigen, müssen zahlreiche Hürden überwunden werden. In einem ersten Schritt werden die wenigen Tumorzellen von den gesunden Zellen des Gewebes getrennt. Dazu müssen die Tumorzellen einen phänotypischen Unterschied (z. B. Oberflächenmarker oder Zellgröße) zu den gesunden Zellen aufweisen. In einem zweiten Schritt erfolgt dann die Kultivierung der Tumorzellen unter sehr spezifischen Kultivierungsbedingungen (in vitro und/oder in vivo), die ein uneingeschränktes Wachstum der DTC und CTC ermöglichen.

In beiden Schritten stellen sowohl die phänotypischen Unterschiede zwischen Tumor- und gesunden Zellen als auch die sehr stark variierenden Wachstumsbedingungen bei verschiedenen Tumorerkrankungen eine Herausforderung dar. Wir beschäftigen uns daher insbesondere damit, maßgeschneiderte Protokolle zur Expansion von DTC und CTC verschiedener Ursprungsorgane zu erstellen. Zudem verwenden wir die expandierten Zellen, um präklinische Modelle (in vitro/in vivo) zu etablieren, in denen wir spezifische Bedingungen des Herkunftsgewebes der Tumorzellen imitieren (z. B. humane Immunzellen). Solche Modelle ermöglichen es uns, das Therapieansprechen dieser Zellen im Patienten nachzustellen.

Die Detektion und Analyse von zirkulierenden Tumorzellen (kurz CTCs für engl. »Circulating Tumor Cells«) im peripheren Blut von Patienten mit Metastasen rückte in den vergangenen Jahren immer mehr in den biomedizinischen und klinischen Fokus. Denn diese gestreuten Zellen - zirkulierende Tumorzellen - können wichtige Informationen zur Prognose, zum Verlauf einer Krebserkrankung sowie dem individuellen Ansprechen auf die Krebstherapie liefern.

Isolierung von Tumorzellen durch »liquid biopsy«  

Neben der Quantifizierung bietet eine molekulare Charakterisierung die Möglichkeit, das genetische Profil der zirkulierenden Tumorzellen zu analysieren. Dadurch können maßgeschneiderte Behandlungen gezielt eingesetzt werden. Gerade bei inoperablen, soliden Tumoren, wie bei der aggressiven Form von Lungenkrebs - dem kleinzelligen Bronchialkarzinom (Small-Cell Lung Cancer, SCLC) – stellt die Blutentnahme zur Isolierung von Tumorzellen, die sogenannte »liquid biopsy«, eine nichtinvasive Alternative für die Diagnostik dar. Da zum Zeitpunkt der Diagnose die Tumorzellen meist bereits extensiv gestreut  haben und zudem die Chemotherapie häufig zur Entwicklung von Resistenzen führt, sind die Überlebenschancen von SCLC-Patienten bislang sehr gering. So liegt trotz moderner Krebstherapien die Fünf-Jahres-Überlebensrate bei dieser Tumorentität bei nur etwa 2 %.

Entwicklung neuer Zellmodelle

Um zukünftig wirkungsvollere Therapieansätze entwickeln zu können, werden daher adäquate, patientennahe Zellmodelle benötigt. Diese Zellmodelle sollen die molekularen Eigenschaften der Tumorerkrankung darstellen. Hierzu wurden am Fraunhofer-Institutsteil in Regensburg präklinische In-vitro- und In-vivo-Modelle aus CTCs von Patienten entwickelt, die die Expansion dieser wichtigen Zellen ermöglichen. Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit (meist nur 1 bis 300 CTCs/ml Blut) und Zellviabilität ist es eine große Herausforderung, die zirkulierenden Tumorzellen nach der Isolierung ex vivo über einen längeren Zeitraum in einem überlebensfähigen, proliferativen Zustand halten zu können. Daher verfolgten die Wissenschaftler mit der Etablierung von kombinierten In-vitro- und In-vivo-Ansätzen unterschiedliche Strategien zur Kultivierung. So konnten sie aus Blutproben von zwei SCLC-Patienten die zirkulierenden Tumorzellen erfolgreich isolieren, unter optimierten Bedingungen vorkultivieren und/oder im Mausmodell expandieren.

Eigenschaften der zirkulierenden Tumorzellen im Zellmodell nachgewiesen  

Die molekularbiologischen Untersuchungen haben folgendes gezeigt:

Diese Modelle exprimieren SCLC-spezifische Tumormarker wie EpCAM, CD56 oder Cytokeratin.

Die Modelle weisen die gleichen Mutationen auf, die auch im Genom der CTCs von Patienten gefunden werden, selbst wenn sie über einen längeren Zeitraum in vitro oder in vivo kultiviert werden.

Eine genetische Analyse des Gesamtgenoms (comparative genomic hybridization) bestätigte, dass die generierten Zellmodelle in der Tat die molekularen Eigenschaften der zirkulierenden Tumorzellen des Patienten darstellen.

Neue Zellmodelle ermöglichen das Testen neuer Krebstherapien

Diese neuen Zellmodelle repräsentieren somit die tatsächlichen Zielzellen einer systemischen Krebstherapie. Sie ermöglichen die Erforschung von Metastasierungsprozessen und Resistenzmechanismen sowie die Austestung neuer Therapieverfahren für die Behandlung von Patienten mit SCLC. 

Disseminierte Tumorzellen (DTC) gehören mit 1-10 detektierbaren Zellen je 10⁶ Knochenmarkzellen zu den seltensten Zellpopulationen im menschlichen Organismus. Dennoch können wertvolle Informationen wie z. B. die Identifizierung von therapeutischen Zielstrukturen (Antigene, T-Zell-Epitope, Signalwege) mittels direkter Ex-vivo-Analyse aus isolierten DTC gewonnen werden. Für die Validierung von Zielstrukturen und ihre funktionelle Analyse sowie für epigenetische, proteinchemische, metabolomische und biochemische Charakterisierungen werden jedoch zusätzlich geeignete zelluläre Modelle benötigt.

Aus diesem Grund besteht ein Forschungsschwerpunkt des Fraunhofer ITEM in Regensburg in der Etablierung von DTC-Zelllinien, insbesondere von Patienten, bei denen noch keine manifesten Metastasen vorliegen. Dies beinhaltet die Definition von Tumor- und Gewebe-spezifischen In-vitro-Kulturbedingungen und -zeiträumen, welche die Situation im Patienten widerspiegeln. Die generierten Zelllinien werden bezüglich ihrer genotypischen und phänotypischen Eigenschaften mit den ex vivo isolierten DTC verglichen und sollen als Modell für die molekularen Eigenschaften von disseminierten Tumorzellen im Patienten dienen.

Übertragung komplexer Biomarker in molekulare Diagnoseverfahren

Ein Ansatz zur Entwicklung von Biomarkern, der Mutationsprofile und/oder Genexpressionssignaturen berücksichtigt, bringt es mit sich, dass der mit einem bestimmten klinischen Verlauf korrelierende Biomarker in ein robustes Testverfahren übertragen werden muss, das auf weitverbreiteten Analyseplattformen anwendbar ist. Über das zertifizierte und akkreditierte Labor für Einzelzelldiagnostik (Link zu Molekulare Diagnostik, B. Polzer) haben die Fraunhofer-Wissenschaftler in Regensburg Zugriff auf eine Vielzahl von Proben, anhand derer sie prüfen können, ob ein molekularer Test aussagekräftig genug ist, um damit den weiteren klinischen Krankheitsverlauf vorhersagen zu können. Darüber hinaus ermöglicht der Zugriff auf eine Biobank mit ausreichenden Mengen qualitativ hochwertiger Einzelzellproben auch eine Anpassung der molekularen Testverfahren an die sich ständig ändernden Technologien.

Derzeit verwendete In-vivo-Tumor-Mausmodelle sind entweder reine Mausmodelle, welche größtenteils auf der Expression von Onkogenen basieren, oder humane Xenograft-Modelle in Abwesenheit eines Immunsystems. Beide Modelle spiegeln nicht ausreichend die Situation im Patienten wider und sind insbesondere für immunmodulatorische Therapieansätze wenig geeignet.

Das Fraunhofer ITEM in Regensburg entwickelt daher optimierte Xenograft-Modelle, die es ermöglichen, einerseits die Tumorentstehung sowie andererseits auch die Streuung der Krebszellen in verschiedene Organe basierend auf DTC oder CTC von Patienten zu untersuchen. Zusätzlich wird in den Mäusen ein humanes Immunsystem induziert, welches die humanen DTC-/CTC-Tumore infiltriert und mit der Patientensituation vergleichbare Immunpopulationen ausbildet (z. B. Tumor-assoziierte Makrophagen). Dieses doppelt humanisierte Mausmodell ermöglicht tiefgreifende Untersuchungen der Interaktionen zwischen humanen Immunzellen und einer humanen Tumorerkrankung. Unser Forschungsschwerpunkt besteht insbesondere darin herauszufinden, wie humane Immunzellen die Tumorentwicklung, den Metastasierungsprozess und das Therapieansprechen der humanen Tumorzellen beeinflussen.